早期诊断比较困难，因为病人很难确定疼痛是由于原来的穿孔伤或是由于感染引起的，而且外伤性眼内炎症也已存在。开放性眼外伤均需行X线、眼眶CT和B超检查以排除眼内异物。对有明显危险因素的病例，如锐器穿孔伤、球内异物应列为高度怀疑的对象，密切观察。
而钝挫伤引起的眼球巩膜破裂则较少有眼内感染的可能性。要根据临床症状和体征初步诊断或列入可疑诊断，注意眼内的炎症表现已超出了外伤性炎症的程度。如发现前房内或玻璃体中有绒球样混浊，此为真菌感染的特征。
经标准化的超声诊断对确定感染的程度和范围有一定价值。A超扫描，中度的感染性眼内炎常显示为玻璃体内有一连串的低幅度小尖波；B超显示为弥散的细亮点。如果感染病灶在前部，后面仍有混浊点，一般前部的混浊要致密些。
如果整个玻璃体腔受累，则在玻璃体内有比较均一的混浊点。如果在感染前不存在玻璃体后脱离，由于感染时玻璃体后皮层与视网膜产生炎性粘连，玻璃体后层仍会保持附着。还可看到视网膜脉络膜弥漫性增厚，渗出性或牵拉性视网膜脱离。
在某些情况下，需要鉴别玻璃体混浊是由于感染还是出血，尤其是临床表现不能肯定有炎症时。主要的鉴别点在于，玻璃体积血比感染性眼内炎更常见有较广泛的玻璃体后脱离；由于重力作用，玻璃体积血时常在下方有玻璃体膜形成。如果玻璃体内有明显均一的炎症，一般看不到这些情况。
ERG检查对伤眼视网膜功能评价也是重要的。由于疼痛和眼睑肿胀，不能应用角膜接触电极，但可用线形或皮肤电极以及明亮的闪光刺激得到。使用的亮度可达到正常闪光刺激的10万倍，足以使光线刺激透过眼睑。
如果此时存在ERG，可以确定有一定的视网膜功能；无反应则是坏兆头，但不能证实没有视网膜功能，因为穿孔伤后的玻璃体积血或混浊使光学密度增大。
病原学检查是确定病原非常可靠的方法，不仅有助于诊断，更重要的是可以指导治疗。常用的检查方法是涂片和培养，涂片可比较快地确定细菌的类型。取标本的方法有前房穿刺、抽取玻璃体、角巩膜伤口分泌物或剪除的眼内组织（坏死污染的虹膜、脱出的玻璃体和晶状体）等，其中以抽取玻璃体做细菌培养极具有诊断价值。眼内炎细菌培养的阳性率约为56%。
标本做细菌和真菌涂片时，前者革兰染色后寻找革兰阳性菌或阴性菌；后者用2%KOH处理后找菌丝和孢子。细菌培养用牛肉汤和血平板；厌氧菌用血琼脂培养基在无氧条件下培养；真菌培养用沙保平板。细菌培养阳性者应做菌种鉴定及药物敏感试验。
